各种不同的分析、分离纯化和结构鉴定技术应用于药物研发的整体过程,其中对化合物的纯度确定是分析工作的重要内容之一。在新药研发过程中,许多待标定的化合物是新化合物,没有已知纯度的自身标准品。这时,需要经验丰富的分析人员对化合物进行各种不同的测试,主要包括HPLC纯度、有关物质、杂质、水分、残留溶剂、无机盐等等,然后计算待测化合物的纯度。这个传统的物料平衡法需要的样品量较大,并且非常耗时。
近些年来,利用定量核磁技术对化合物的纯度进行标定得到了越来越广泛的应用。定量核磁的原理是什么?具体的操作流程如何?在药物研发中具体有哪些实际应用?下面就这些问题做了详细的讲解。
NMR定量分析是通过比较不同的吸收峰强度实现的。在进行定量分析时,对于确定的质子,其积分与其摩尔浓度成正比。如图1中左侧公式所述,Pa, Ia, Na,Ma, Wa分别表示待测物的纯度,某一化学位移的积分值,该信号的质子个数,待测物的摩尔质量和待测物的称量质量;Ps, Is, Ns, Ms, Ws分别表示标准品的纯度,标准品某一化学位移的积分值,该信号的质子个数,标准品的摩尔质量和标准品的称量质量。在进行计算之前,需要了解化合物的各组成基团上质子所产生的化学位移值,并选择一个合适的峰用来纯度计算。定量核磁灵敏度高,无需专门仪器,操作也相对简单。如图2所示,分别称量待测样品和标准样品于样品瓶中,加入氘代试剂充分溶解,取适量加入核磁管中进行核磁检测;随后进行谱图测试及处理,最后进行分析计算。从定量核磁计算公式中可以看出,影响结果的因素为样品称量准确度和谱图积分准确度。因此在操作过程中,为减少误差,推荐称量量在10mg以上;选取氘代试剂完全溶解样品;设置采样参数,将弛豫时间D1设为5倍T1以上,信噪比S/N在150以上;在谱图处理过程中,选择干扰较少,峰型较好,基线平稳的质子进行积分。活性药物的纯度对药物本身来说至关重要。某药物最初的动物实验表明,其杂质的心血管风险比活性药高3-5倍,这就决定了需要进一步进行长期动物试验,评估该杂质的心血管风险,进而确证杂质控制的标准限度。对于进行动物试验的样品,仅参考HPLC纯度是不够的,并且HPLC测得纯度似乎不那么“可靠”,同一样品测定的HPLC纯度为99.12%的化合物在定量核磁中只有89.2%的纯度(图3)。这是什么原因呢?用同一个做过定量核磁的样品,进一步测了碳谱和二维谱图。在核磁谱图中,如图4a所示,对所有的氢进行归属,大部分是目标化合物的信号峰,但是在化学位移2.7ppm左右有一个很强的峰,属于杂质峰。结合二维谱图分析,确定了2.7ppm信号对应的杂质结构。结构决定性质,该化合物在254nm波长没有吸收,选取短波长210nm级,在紫外上就可以看到3.8左右有一个峰,提取离子流,正是该化合物的M+1峰。从 LCMS分析(图4b)的结果证明,样品里边的确含有1,1,3,3-tetramethylurea这一杂质。采用同样的逻辑,判定其他相对主要的杂质信号,图5a所示,在水峰3.3ppm两边,有一组多重峰。通过对核磁谱图中的氢归属及二维谱图分析,确定了另外一个杂质的结构(DIPEA)。同样,再结合LCMS(图5b)数据,进一步证实了第二个主要杂质DIPEA的存在。通过混合样品的核磁数据确定了化合物结构,同时通过LCMS进行了分子量确认。接下来按照定量核磁的计算公式,进行多组分纯度确定。如图6a和图6b所示,结果显示杂质1(tetramethylurea)含量约6%,杂质2(DIPEA)含量约1.1%,这些数据清楚明白地解释了目标化合物为何纯度是89%。从合成路线分析杂质来源,进一步解释杂质存在的合理性。如图7所示,反应过程中缩合试剂HATU产生第一个杂质,DIPEA作为碱试剂被引入,产生第二个杂质。毫无疑问,在做动物实验前,需要进行杂质分离,对化合物进一步纯化。如图8所示,传统的HPLC物料平衡法计算方法,需要做很多检测,排除相关杂质、挥发性、水分、残留溶剂、无机盐等,才可计算出HPLC纯度。该方法需要的样品量较大,分析技术要求高,而且耗时长。相比于此,定量核磁具有无需自身对照品,化合物用量少、分析速度快、准确性较高,适应于水分敏感化合物,单组分和多组分纯度均可确定,定性和定量可以同时进行等多项优势。